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   首页 >> 公司论文 >> 鸡新城疫-禽流感超高静水压灭活二联油乳剂疫苗的研究

 
 
 

    建议继续开展以下研究:
    1.鸡新城疫-禽流感超高静水压灭活二联油乳剂疫苗的研究(包括繁毒、高静水压灭活、甲醛灭活、制油佐剂、制备疫苗、免疫效果测定等)
    2.酵母菌超高静水压破壁试验研究(包括繁殖酵母菌、高静水压破壁试验、破壁酵母与未破壁酵母动物添加饲养试验等)

鸡新城疫-禽流感超高静水压灭活二联油乳剂

疫苗的研究

张安国1 王家忠2 贾培起2 王舟佳1 王海风1 高晶晶1 刘艳芳1
(1.天津农学院动物科学系 300384,2.天津市森森生物工程技术有限公司 300100)

    鸡新城疫、禽流感是危害养鸡业发展的两种重要的病毒性传染病,广泛流行于包括我国在内的世界各地,给养鸡业造成了巨大的经济损失,严重的影响着养鸡业的发展。目前对禽流感主要应用特定血清型毒株研制的灭活疫苗进行预防和控制,对鸡新城疫的免疫防治,虽然现有几种弱毒疫苗,但弱毒疫苗不易保存,而且易受母源抗体干扰,免疫效果不稳定,所以目前也主要应用灭活疫苗进行预防。
    在灭活疫苗研制过程中,病毒的灭活长期以来主要采用热力、化学处理等方法,但这些技术都存在一些弊端,而超高压技术在这方面则具有广阔的发展前景。用超高压技术处理的病毒可以提供一个完整的病毒颗粒,这种颗粒不仅丧失厂原来的感染性,且保持了原病毒的免疫原性,可以诱导产生与原病毒相同的免疫反应,所以超高压技术在制备疫苗方面有极大的应用潜力。自然界中的病毒从结构组成方面可分为无包膜病毒和有包膜病毒,无包膜病毒的耐高压性较强,故人们研究较多的是有包膜病毒。对于有包膜病毒的热力致死主要是由于病毒包膜结构破坏、酶失活、蛋白变性、DNA或RNA断裂损伤等原因造成。而其静水高压致死病毒则主要由于超高压可引起病毒膜结构内部非共价键结合的破坏,膜衣壳蛋白亚单位之间解体。这种解体在减压以后又有可逆性重组,但由于病毒颗粒蛋白成分的复杂性,这种重组不能恢复如初,而使膜衣壳蛋白空间结构发生变化,引起膜构象转换,生物活性改变。病毒颗粒丧失感染性,同时又由于超高压并不破坏共价键,作为抗原的单个亚单位不破坏,故其免疫原性不变。Pontes等曾用电镜、光谱分析等方法检测了轮状衣壳蛋白的重组现象。Nakagaml等也曾报道,超高压可显著降低病毒颗粒对正常细胞的吸附能力,使其丧失感染性。总之,超高压可以通过多种机制致死病毒,而在其导致病毒感染性大大降低的同时,病毒免疫原性保持不变。Jurkiewicz等也提出在灭话病毒的同时,病毒基因组不变,故不引起可遗传的变异。
    自1895年Rogar等首次报道了超高压可以杀死微生物以来[1],应用超高压技术的研究报道在国外陆续出现。超高压技术作为一种有效的物理灭菌手段已成功地应用于生物工程的多个领域,如转化大分子结构、修饰酶活性、改变微生物代谢及基因表达[2]。尤其近年来欧、日等将超高压技术应用于食品加工工业以来,它的应用领域进一步扩展[3]。但应用超高压技术灭活病毒,研制疫苗的研究只不过几年的历史。池元斌等[3](2001)以250MPa的静水压力对犬瘟热病毒(CDV)处理30min之后CDV被灭活,由其制成的灭活疫苗诱导犬产生中和抗体的能力明显优于传统的幅尔马林灭活疫苗,免疫保护率达90%。电镜观察显示,经不同程度静水压力处理后的CDV粒子均发生变形,表面呈现凸起,但CDV H基因部分片段的RT-PCR扩增结果揭示,高达510 MPa的静水压力作用30 min也未能使其基因片段受到破坏。夏咸柱等[4](2000)用静水压高压灭活的方法对CDV进行灭话,并加入蜂胶佐剂制备犬瘟热病毒高压灭活疫苗。用此灭活疫苗免疫接种CDV易感犬,同时以用福尔马林灭活的犬瘟热病毒灭活疫苗为对照,检测结果表明犬瘟热病毒高压灭活疫苗安全、可靠,其诱导试验犬所产生中和抗体的能力明显高于该病毒的福尔马林灭活苗,临床应用证明该疫苗对犬的保护率达89%。余春等[5](2000)使用静水压高压灭活的方法制备犬冠状病毒(CCV)蜂胶佐剂灭活苗。将此灭活苗免疫接种易感犬,同时以CCV甲醛灭活苗作对比试验。结果表明CCV压力灭活苗安全可靠,其免疫试验犬产生中和抗体的能力明显高于该病毒的甲醛灭活苗,临床应用证明该灭活苗可以控制犬冠状病毒性肠炎的发生与流行。应用超高静水压技术,研制其他家畜和家禽疫苗的研究目前尚未见报道。
    基于超高压灭活病毒的诸多优点,也为了减少疫苗免疫次数和鸡群应激,减少免疫费用,提高免疫效果,本研究旨在试验探讨利用超高静水压技术,对鸡新城疫、禽流感病毒进行超高静水压灭活,将两种病毒超高压灭活抗原混合制成鸡新城疫-禽流感二联超高静水压灭活疫苗,用其对试验鸡群进行免疫,测定免疫后鸡群不同时期血清抗体效价和强毒攻击保护率,并以常规灭活(甲醛)二联苗作对照,观察二这免疫效果之差异。本研究将为养鸡业防治此类传染病提供一种经济有效方法,为天津市森森生物工程技术有限公司研制的超高压生物处理试验机的开发使用,及利用该技术研制相关疫苗提供依据。

1 试验材料和方法
1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器 超高压生物处理试验机,型号HPB.A2-600/0.4,由天津市森森生物工程技术有限公司与清华大学智能技术与系统国家重点实验室联合研制。净化工作台、高压灭菌器、干热灭菌器、恒温培养箱、细菌滤器、胶体磨、离心机、微型震荡器、微量移液器、微量试验板等天津农学院动物科学系动物预防医学实验室常规仪器。
1.1.2 制苗病毒株 新城疫病毒(La sota株)、禽流感病毒H5株、禽流感病毒H9株,为天津农学院动物科学系动物预防医学实验室鉴定保存毒种。
1.1.3 试验鸡胚 由天津市兴华养鸡场购买,鸡胚健康,相关抗体效价较低。
1.1.4 试验用鸡 由天津市兴华养鸡场购买,10~40日龄,健康,相关抗体效价较低。
1.1.5 试验试剂 7号白油、司班-80、吐温-80、甲醛、硬脂酸铝等试剂,分别由化学试剂公司和天津红岩化工厂购买,质量、纯度符合制苗要求。
1.2 病毒抗原的制备
1.2.1 病毒活化 将各病毒种毒无菌稀释后接种10日龄鸡胚,每胚0.2ml,培养72~96小时,冷冻,收取病毒液分装保存,测病毒效价(用HA法或动物试验、测EID50)。
1.2.2 病毒繁殖 将病毒液无菌稀释后接种10日龄鸡胚,每胚0.2ml,培养72~96小时,冷冻,收取病毒液,分装保存,测病毒效价(用HA法或动物试验)。
1.2.3 病毒的灭活
1.2.3.1 病毒超高静水压灭活 将各病毒液无菌过滤分装,分别在(250Mpa、300Mpa、350Mpa、400Mpa、450Mpa)的静水压力下分别保压灭活30、45min。
1.2.3.2 病毒的甲醛灭活
1.2.4 病毒灭活效果测定 将各灭活病毒液,无菌稀释后接种10日龄鸡胚,每胚0.2ml,培养72~96小时,冷冻,收取可疑病毒液,分装保存,检测测病毒(用HA法或动物试验、测EID50)。
1.3 二联油苗的制备
1.3.1 佐剂的制备
1.3.2 二联苗的乳化
1.3.2.1 超高压二联苗的制备
1.3.2.2 甲醛灭活二联苗的制备
1.3.3 疫苗的物理性测试
1.3.4 疫苗的安全性测试
1.4 疫苗免疫试验
1.4.1 免疫分组 超高压二联苗、甲醛灭活二联苗不同剂量免疫分组鸡,设对照组。
1.4.2 免疫抗体测定 测定免疫组、对照组鸡体两种抗体效价。绘制抗体曲线图。
1.4.3 攻毒试验
1.4.3.1 强毒来源
1.4.3.2 攻毒方法

2 结果
2.1 病毒增殖与灭活

2.1.1 病毒液效价
2.1.2 病毒灭活效果 各灭活病毒液,无菌稀释后接种10日龄鸡胚,培养后,收取可疑病毒液,病毒检测结果(用HA法或动物试验)。
2.1.2.1 病毒超高静水压灭活效果
2.1.2.2 病毒的甲醛灭活效果
2.2 二联油苗的安全性
2.2.1 疫苗的物理性状
1.3.4 疫苗的安全性
2.3 疫苗免疫效果
2.3.1 免疫抗体效价 免疫组、对照组鸡体两种抗体效价。抗体曲线图。
2.3.2 攻毒试验保护率

3 小结与讨论
3.1
3.2
3.3

参考文献
[1] 圆池耕一郎. 食品工业,1994,4:27~32
[2] Zhaev M.et al. Trends Biotechnol,1994,12:493~501
[3] 池元斌,夏咸柱,王雪梅,等. 犬瘟热病毒的静水压灭活。中国兽医学报,2001,20(1):35~37
[4] 夏咸柱,池元斌,余 春,等. 犬瘟热病毒高压灭活疫苗的制备与应用。中国兽药杂志,2000,34(2):6~8
[5] 余 春,夏咸柱,池元斌,等.犬冠状病毒压力灭活苗的制备与应用研究。中国兽医科技,2000,30(5):5~7

 

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